奶牛隐性乳房炎检测方法
发布时间：2014-04-08 来源：奶牛吧
1 隐性乳房炎的危害
奶牛乳房炎是世界乳牛业的主要危害因素之一。它不仅影响奶牛的产奶量，严重时使奶牛遭到淘汰，甚至还影响乳的品质，危及人类健康。据报道，国内奶牛乳房炎的发病率大约是20%一70%，其直接经济损失也不少21亿。目前，全世界约有1/3的奶牛患有各种类型的乳腺炎。据资料记载，临床型乳腺炎占奶牛总发病的21%-23%，其淘汰牛占奶牛总淘汰率的9%0-10%，因其造成奶量明显下降，甚至乳区化脓、坏疽，失去泌乳能力。
2 隐性乳房炎的病理过程及特点
乳房炎是一种复杂的疾病，其病原菌很多，它的发生是病原、机体防卫功能和外界环境因素共同作用的结果。金色葡萄球菌和链球菌是引起奶牛隐性乳房炎的主要致病菌，病原菌数中所占的比例大小依次为停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌。还有支原体、病毒等也可引起奶牛隐性乳房炎。奶牛隐性乳房炎的病理过程和普通炎症过程相似、一致。主要表现为感染细菌及其毒素对乳腺组织和毛细血管作用，毛细血管渗透性增加，炎性渗出物浸出，如各种免疫蛋白有单核巨筮细胞、中性粒细胞、多形核粒细胞。与此同时体细胞脱落增加、过氧化物酶、髓过氧化物酶、凝固酶、C-反应蛋白、间质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)、氯化物无机离子等都存在于奶汁中。
3隐性乳房炎检测方法的研究进展
3.1 国内隐性乳房炎检测方法的研究进展
3.1.1简易诊断
诊断液配方1：把30克洗衣粉溶于1.5升热水中，加热至沸腾，沸腾时间不超过1分钟放置3-4小时，然后将上清液吸出，或用几层纱布过滤即可。诊断液配方2：磷酸三钠80克，烷基苯磺酸钠40克，苛性钠5克，溶于1升水中室温避光保存。使用方法:挤出1-2毫升牛奶，放到试管中，加入1ml诊断液，水平旋转混合，如成为均匀的液体混合物，则判为阴性，即无病，如存在单个粘液线，则为可疑症.如整个为粘液质或胶状凝集为阳性.即患隐性乳房炎。
3.1.2乳汁澄清法诊断乳腺炎
特制的一种玻璃试管，其内径不得大于14rnm，取乳量不得少于10ml。其方法是在挤乳后，从每一乳头收集残乳10-15m1，在冰箱或别的冷处放置16-18个小时，然后在第二天可见到试管底的沉淀物厚度在O2.5px以上，呈略带黄色或兰色，乳酪层呈粘滞、粘液状，例如，管径为13rmn，乳量1 Om1。第二天观察可见乳柱75mm高，乳酪7mm厚，乳清66mm高，底部沉淀物2mm厚，上述检查完毕，再取沉淀物一滴制成抹片，自然干燥，甲醇固定5分钟，罗曼诺夫染色法染色。镜检发现有各类上皮细胞，巨噬细胞，组织细胞、中性白血球、嗜酸细胞、淋巴球以及其它体细胞等，即可确诊为隐性乳房炎。
3.1.3奶牛隐性乳房炎快速检测方法
用杯泸法检查有无乳块、絮状物或纤维丝等沉淀物，如有即为阳性。用溴麝香草酚蓝试验测定牛乳PH值，呈黄绿色(PH6.5以上)为正常乳、绿色(PH6.6)为可疑、蓝色至青绿色(PH6.6)为阳性。牛乳氯化物测定，黄色为阳性，表示氯化物含量超过0.14%，棕色为阴性。4%苛性钠凝乳试验法:检查牛乳有凝块等沉淀物，可确诊为隐性乳房炎。该法检出率高,简便易行,是目前检查乳腺炎最常用的一种方法。
3.1.4电导仪检测
近年来为快速诊断奶牛隐性乳房炎进行了大量的研究，研制出了许多新的检测仪器，如CN型乳腺炎电子检测仪。这一检测仪是利用牛奶的离子浓度变化而引起的导电性差异而进行诊断，操作简便迅速，适用于现场检验，并可立即得出结果。
3.1.5体细胞法
白细胞随着血液不断循环，当身体受到感染或伤害时，它们就抵达受伤部位。白细胞中数量最多的一种是巨噬细胞，其主要作用是吞噬细菌;第二种是淋巴细胞，尽管数量较少，但却起着控制免疫反应和产生抗体以抗拒细菌破坏的重要作用。此外还有多形核嗜中性白细胞。体细胞数的升高说明免疫系统发出警报：多项研究证实乳腺感染、牛奶质量及体细胞数之间有紧密的联系。
3.2 国外隐性乳房炎检测方法的研究进展
用DNA指纹图技术检测牛临床性乳腺炎。荷兰学者从平均乳体细胞计数<150000/ml和临床性乳腺炎年发病率在25%以上的7个奶牛群采集奶样，分离大肠埃希氏菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)，提取菌体DNA。用E.coli的肠杆菌基因间重复一致引物和S.aureus的随机扩增多形态DNA引物，做多聚酶链反应(PCR)，对提取菌体DNA进行放大，用DNA指纹图技术对两种菌分离株进行鉴定和鉴别。
加洲乳腺炎测定法CMT在国外应用的很广泛，应用的是体细胞检测原理。
用各种PCR技术挑选测验隐性乳房炎奶样中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、病毒、支原体。这种方法是监视乳腺炎的有效检测方法，对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、病毒、支原体都作了PCR研究，以选择最适合的应用范围，并对奶牛乳腺炎进行监视。PCR检测方法比体细胞检测和细菌学检测更有应用价值。但是对突然感染葡萄球菌检测价值不大。只能在实验室操作且操作技术要求高。
在患隐性乳房炎奶牛的乳样中应用间接ELISA检测支原体。用多叶核粒细胞单克隆抗体的免疫方法检测乳腺炎。用凝固酶试验检测乳腺炎奶样中金黄色葡萄球菌。凝固酶试验是检测金黄色葡萄球菌乳腺炎的一种单一可行的方法体系，用乳腺炎奶牛乳汁和兔的柠檬酸血浆混合在37℃培养使其形成血凝块，即判为阳性。检测正确率达91.5、诊断敏感性达88.5。测定病原单一、不能函盖大部分病原所至的隐性乳房炎。用手握式导电仪检测临床奶牛对隐性乳房炎的鉴定。乳腺炎奶汁中炎性渗出电解质增多使液体导电性增强，从而用导电仪检测奶液的导电性就可确定隐性乳房炎。尚未在牛场得到广泛应用。应用软件技术检测确定牛的乳腺炎。专家加工和抽取了乳腺炎的特征性病症指标，并将其应用IT技术研究了一套乳腺炎检测应用软件。数据以各种备选方案对临床乳腺炎情况进行判断、解释、提出见意。生物遥感仪技术测乳房皮温以检测奶牛隐性乳房炎。国外应用检测N-乙酰-ß-葡萄糖胺酶的活性以诊断乳头导管的炎症。
4 隐性乳房炎检测方法的未来趋势
随着现代生物技术的发展，对疾病的检测深入到分子水平，应用单抗技术有针对性地对疾病的指示物进行检测。根据乳腺炎的病理生理特点以检测隐性乳房炎，例如C-反应蛋白、髓过氧化物酶、氯化物等指示性物质在检测奶牛隐性乳房炎的可行性作了深入的研究：
4.1 C-反应蛋白
C反应蛋白 (CRP)是一种非特异性的急性时相蛋白，CRP是一种能与肺炎链球菌C多糖体特异结合。正常血清中含量极微，而在各种炎症、恶性肿瘤、组织损伤等疾病，含量急剧上升，当病情缓解时又能迅速恢复正常，反应的急性期反应蛋白，广泛分布于机体胸水、腹水、关节液、心包液、血液等处。当奶牛患乳腺炎时，乳汁中的C-反应蛋白指标会显著升高。目前，检测CRP有多种方法。国外常采用的是胶乳凝集法和ELISA方法。
4.2 髓过氧化物酶
被激活后的白细胞释放的一种颗粒。髓过氧化物酶主要参与依赖氧的杀菌活动，隐性乳房炎奶汁中含有超量的MPO，髓过氧化物酶可作为奶牛乳腺炎的指示物：用一种特异的ELISA方法检测牛奶中MPO来诊断乳腺炎，对此瑞典的Cooray R.进行了精确的评估。ELISA用了两种特异性抗体，MPO单克隆抗体和MPO多克隆抗体。总共对141份奶样的体细胞数和ELISA检测MPO浓度得出的相关系数值为0.91,奶中MPO的ELISA结果显示了很好的精确性和准确度。奶样中随着MPO浓度增加分离的微生物的量也提高。现国外已有髓过氧化物酶检测试剂盒。
4.3 氯化物
患奶样乳腺炎奶汁炎性渗出增多，电解质增多，导电性增强。其中主要是患奶中的氯化物增多，在临床上正常奶汁的氯化物浓度有一个有限范围，当患隐性乳房炎时奶汁中氯化物浓度超出正常值许多倍。经研究乳汁中的氯化物水平和产乳量无相关性，氯化物水平只与乳腺炎症有关。应用Cl离子和Ag离子沉淀原理,德国已报道了检测氯化物的试纸条。
5 结语
上述提到的国内的简易诊断方法、快速检测方法不够精确和准确，诊断误差比较大。体细胞检测方法在临床应用最广，精确度和准确性比一般的快速检测方法要高些，但是乳汁中体细胞数在不同的生理阶段标准也不同，在临床上很难找到这些不同的标准可参考。国外应用的PCR技术、DNA图谱技术和免疫学技术诊断奶牛的精确度较高，这种技术是新兴的先进的生物技术，要求专业化程度高、设备昂贵，在我国的实际国情很难推广应用。软件技术检测奶牛隐性乳房炎适用于大型奶牛场的办公化设备，在我国小型养殖场也不利推广应用。近些年国外奶牛隐性乳房炎检测的研究，针对乳腺炎症时的特异性物质进行检测，通过单克隆抗体ELISA等免疫学技术，还有酶活性反应方法检测，如凝固酶、髓过氧化物酶、C反应蛋白、间质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)、免疫球蛋白、氯化物、N-乙酰-ß-葡萄糖胺酶等物质在乳汁中特异性检测。这些特异性物质检测方法可以组装成试剂盒或试纸条，这样既保证了检测的特异性、精确度，又保证了检测的方便快捷，易于推广，这是我们在隐性乳房炎检测研究的突破口。（吉林大学畜牧兽医学院）